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斑马鱼脑-高分辨率全器官江苏体彩

徕卡SP8光谱共聚焦激光扫描显微镜对斑马鱼全脑江苏体彩zebrafish_brain.jpg

当人们试图了解复杂的生物系统时,结构信息是关键,而最复杂的生物结构之一就是脊椎动物的中枢神经系统。要使从发育中的斑马鱼解剖的完整大脑江苏体彩,就需要在毫米范围内的深度覆盖约十平方毫米的视野。通常,低倍镜无法提供足够的分辨率来揭示神经组织中复杂的结构相互作用。另外,由于散射过程,使用共聚焦显微镜可以在致密的生物组织内江苏体彩的深度通常被限制为大约10微米。

The Solution

威斯康星医学院的链接实验室研究眼部发育和疾病,重点研究斑马鱼视网膜神经发生模型。链接实验室的博士候选人埃里克·克拉克(Eric Clark)试图创建一个深度约为750微米,直径约3毫米的整个斑马鱼大脑的全尺寸3D图像。为了使神经系统江苏体彩,首先在泛神经元启动子后用表达eGFP的构建体转染该动物,从而在CNS的整个神经元中产生普遍存在的绿色荧光。 

样品清除和物镜

为了减少由折射率(RI)的变化引起的散射,通过被动清澈清除了解剖的CNS样品。使用定制的基于Histodenz的折射率匹配解决方案来在整个光路中保持一致的RI。使用Leica HC FLUOTAR L 25x / 1.00 IMM物镜对准备好的器官江苏体彩 [1],可在大约1mm x 1mm的视场中提供250 nm的光学分辨率,最大自由工作距离为6 mm。该物镜配备了电动校正(motCORR)轴环,可以对其进行调节以补偿深度RI变化的影响。

动画:eGFP染色斑马鱼(泛神经元启动子)的3D渲染视频动画。总尺寸为0.75 x 2.5 x 3毫米。 5675 x 7836 x 286像素过夜记录。激发488nm。发射499-569nm。更多详细信息,请参见文本。

高分辨大视野的集合

为了收集整个大脑的数据,Eric利用了 LAS X NAVIGATOR采集软件。 Navigator允许用户简单地将光学图像堆栈记录在大范围的缝合显微区域中,并将它们融合到单个3D数据集,从而在缝合和采集过程中自动平衡强度变化。可以渲染结果数据 通过 3D可视化软件,其中包括3D查看器 LAS X(参见电影图01)。

最终数据由286个图像平面组成,每个图像平面为5675 x 7836像素。总计12.7 Giga-Voxels。

光子效率和样品保护

从荧光样品中收集此类庞大数据集的前提是非常灵敏的检测系统,这是在相对较短的时间内以最小的光漂白达到高信噪比所必需的。为此,使用配有徕卡几乎无噪声的混合探测器的共聚焦显微镜进行江苏体彩 [1] (HyD),声光分束器 [2] (AOBS),以及基于棱镜的光谱检测器 [3] (SP-检波器),实现无滤波器的频谱分离和自由可调的带宽规格。

The User’s Voice

“带有motCORR的Leica Clarity物镜提供了与样品清除/固定介质的折射率相匹配的能力,并提供了扩展的工作距离和聚光能力,可对这种敏感样品进行深度江苏体彩。”

埃里克·克拉克(Eric Clark)博士威斯康星医学院的候选人。威斯康星州密尔沃基(美国)

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